„Enzymy – katalizatory życia” – felieton

W zeszłym tygodniu próbowałem wyjaśnić, czym są katalizatory. Mam nadzieję, że metafora z zatłoczonym rondem trafiła do Państwa wyobraźni?

Dzisiaj opowiem o enzymach, które katalizatorami działającymi w organizmie każdego z nas.

Enzymy są takimi katalizatorami, które  wiążąc reagenty w swoim wnętrzu w taki sposób, aby maksymalnie obniżyć ich energię aktywacji.

Enzymy są niezwykłymi katalizatorami. Dzięki swojej dość skomplikowanej i wyrafinowanej budowie potrafią działać tylko w określonym miejscu naszego organizmu i w określonych warunkach temperatury i pH. Są w stanie również rozpoznawać cząsteczki chemiczne i spośród wielu obecnych w naszych komórkach wybierać tylko te, do których modyfikacji zostały przeznaczone. Zjawisko to,  nazywane specyficznością enzymów, może powodować że enzymy wybierają wyłącznie jeden rodzaj cząsteczki (np. absolutna specyficzność enzymu laktazy, który katalizuje rozkład wyłącznie laktozy) bądź też jakąś ich grupę (specyficzność grupowa – np. enzym trawienny trypsyna przecinający łańcuch peptydowy w pobliżu zasadowych aminokwasów) lub ograniczać się wyłącznie do rozpoznawania typu wiązania chemicznego (np. niektóre dehydrogenazy alkoholowe utleniają specyficznie alkohole pierwszorzędowe do aldehydów). Enzymy potrafią również rozpoznawać przestrzenną strukturę cząsteczek chemicznych, dzięki czemu potrafią być specyficzne względem tak zwanych izomerów optycznych (enancjomerów) – czyli cząsteczek niemal identycznych, różniących się tylko przestrzenną organizacją podstawników wokół chiralnych atomów węgla. Dzięki enancjospecyficzności enzymy są niezwykle przydatne szczególnie w przemyśle farmaceutycznym, gdzie zdolność do produkcji chiralnych czystych enancjomerycznie leków może decydować o tym, czy produkt będzie miał zbawienne działanie lecznicze, czy też stanie się zagrażającą życiu trucizną.
 Co więcej enzymy potrafią ze sobą współdziałać i wzajemnie wpływać na swoją aktywność – są niczym skomplikowany, samonakręcający się mechanizm zegarowy. Dobrym przykładem takiego zachowania są enzymy trawienne, katalizujące rozkład białek. Enzymy te wytwarzane są m.in. w gruczołach ściany żołądka. Gruczoły te w dużej mierze zbudowane są z białek, więc enzymy trawienne muszą być początkowo nieaktywne (wydzielane w formie tzw. proenzymu – w żołądku to głownie pepsynogen), żeby nie trawiły własnego macierzystego gruczołu. I dopiero wtedy, gdy już wydzielą się do żołądka, gdzie panuje niskie pH (obecny jest tam kwas żołądkowy), ulegają samo-aktywacji (autokatalitycznie same odcinają swój niewielki fragment) i stają się bardzo aktywnymi katalizatorami ułatwiającymi trawienie białek (pepsyna). Dodatkowo nasz żołądek musi być wyścielony specjalnymi komórkami odpornymi na ich działanie – inaczej sami moglibyśmy siebie strawić po jakimś dobrym obiedzie! Co ciekawe inne enzymy trawienne, wytwarzane w trzustce (np. chymotrypsyna), a działające w dwunastnicy (gdzie panuje pH zasadowe) trawią białka tylko i wyłącznie w warunkach wysokiego pH – dzięki czemu również nasza trzustka nie ulega przypadkowemu strawieniu.
Aktywność enzymatyczna (czyli ich zdolność do przyspieszania reakcji) podlega dynamicznej regulacji. Zanim zajdzie reakcja, najpierw musi powstać kompleks między enzymem i substratem (tzw. kompleks ES). Ponieważ sama reakcja chemiczna jest bardzo często wolniejsza od procesu powstawania i rozpadu kompleksu ES, szybkość katalizowanej przez enzym reakcji zależy nieliniowo od stężenia substratu i ma kształt hiperboli. Oznacza to, że w miarę zwiększania się stężenia substratu szybkość reakcji tylko początkowo gwałtownie rośnie po czym przyrost szybkości stopniowo zwalnia, aż osiąga wysycenie. Zrozumienie tego efektu było możliwe dzięki badaniom trójki uczonych: francuskiego chemika Victora Henriego, niemieckiego biochemika Leonora Michaelisa i kanadyjskiej doktor medycyny Maud Menten. To oni sformułowali najsłynniejsze w biochemii równanie Michaelisa-Menten, będące podstawowym prawem opisującym zachowanie enzymów.

Co więcej wiele enzymów zmienia swoją aktywność w zależności od stężenia substratu i innych substancji w sposób jeszcze bardziej złożony. Częstym zjawiskiem jest spowolnienie reakcji gdy powstaje dużo produktu. W ten sposób organizm zabezpiecza się przed akumulacją zbyt dużej ilości substancji chemicznych, które mógłby wywrzeć toksyczny efekt na komórkę. Efekt taki nazywany jest inhibicją produktową, jeżeli produkt wiąże się w centrum aktywnym, lub ujemnym efektem allosterycznym, jeżeli miejsce wiązania się inhibitora-produktu znajduje się w innej części enzymu. Aktywność enzymatyczna może podlegać jeszcze innej regulacji, najczęściej (choć nie jedynie) gdy enzym składa się z kilku jednakowych pod względem składu aminokwasowego podjednostek białkowych, z których każda zawiera centrum aktywne. Mówimy wtedy, że enzym ma budowę multimeryczną (np. jeżeli składa się z czterech identycznych podjednostek, jest homotetramerem. Bardzo często takie enzymy działają kooperatywnie – związanie w jednej z podjednostek substratu powoduje zmianę geometrii białka. Zmiana kształtu podjednostki zawierającej substrat pociąga za sobą przemieszczenie położenia aminokwasów na styku pomiędzy podjednostkami. W efekcie następuje również zmiana struktury pozostałych podjednostek (tzw. zmiana konformacji), które niejako „czują”, że ich sąsiad związał pierwszą cząsteczkę substratu. W rezultacie ich zdolność do wiązania w ich centrach aktywnych cząsteczek substratu (a więc termodynamiczne prawdopodobieństwo powstania kompleksu enzym-substrat) może wzrosnąć (dodatni efekt kooperatywny) lub zmaleć (ujemny efekt kooperatywny). W ten sposób ewolucyjnie zaprogramowany efekt regulacji pozwala organizmowi dostosować efektywność katalizatorów do zmieniających się warunków zewnętrznych (np. zmiennego stężenia substancji odżywczych).

Jak już wspomniałem, enzymy mają bardzo skomplikowaną budowę. Ponieważ są białkami, zbudowane są z tak zwanych aminokwasów. Większość organizmów wyższych (do których i my się zaliczamy) wykorzystuje tylko 21 różnych aminokwasów, które połączone są w długie łańcuchy za pomocą tzw. wiązania peptydowego. To, w jakiej kolejności poukładane są różne aminokwasy w danym białku jest zapisane w kodzie genetycznym (DNA) i w jeszcze nie do końca zrozumiały dla nas sposób niesie tajemniczą informację nie tylko o kolejności (tak zwanej sekwencji) aminokwasów w łańcuchu, ale również o całkowitym trójwymiarowym kształcie białka. Okazuje się bowiem, że dojrzałe białko (czyli np. jakiś enzym) przypomina bardziej kłębek włóczki, którym bawił się młody kociak, niż prostą wstążkę. Nić aminokwasowa przyjmuje skomplikowane, nieraz dość fantazyjne kształty spiral (zwanych helisami), płaszczyzn (beta-kartka), fantazyjnych pierścieni czy kształtów przypominających beczkę.
Niektóre enzymy są naprawdę wielkimi cząsteczkami chemicznymi, składającymi się z wielu splątanych ze sobą łańcuchów i dziesiątków tysięcy atomów. Tym bardziej jest dla nas niezrozumiałe w jaki sposób białka za każdym razem, zazwyczaj bezbłędnie i w większości wypadków zupełnie samoistnie, zwijają się w te skomplikowane struktury. Pomimo wielu badań w tej dziedzinie oraz ogromnego postępu metod symulacji komputerowych zwijania się białek (wykorzystujących techniki tzw. modelowania homologicznego czy dynamiki molekularnej) wciąż nie jesteśmy w stanie przewidzieć z wystarczająca dokładnością trójwymiarowej struktury białek bazując wyłącznie na podstawie sekwencji. To właśnie z tego powodu co roku (od 1994) odbywa się swego rodzaju eksperyment: światowe mistrzostwa w przewidywaniu struktur białkowych CASP (Critical Assessment of protein Structure Prediction) w ramach których ponad 100 grup naukowców rywalizuje w przewidywaniu struktury białka o niedawno poznanej ale wciąż nie opublikowanej strukturze.

Należy sobie jednak postawić pytanie, czemu to w sumie ma służyć tak skomplikowana budowa  białek i enzymów? Enzymolodzy byli bardzo zaskoczeni gdy odkryli,  że niejednokrotnie w samym procesie przyspieszania reakcji bierze udział tylko kilka aminokwasów! Sama reakcja chemiczna zachodzi bowiem w tak zwanym „centrum aktywnym”, które jest najczęściej niewielkim wgłębieniem lub niszą w enzymie, do którego wiążą się cząsteczki chemiczne (substraty) przetwarzane przez enzym. To właśnie w stronę tej przestrzeni centrum aktywnego zwrócone są w precyzyjnie określonych miejscach te aminokwasy, których budowa chemiczna jest przystosowana do przyspieszenia reakcji chemicznej. Od dziesięcioleci próbujemy zrozumieć, jak enzymy osiągają te fenomenalne rezultaty za pomocą relatywnie niewielkich środków. Niestety wciąż poszukujemy pełnej odpowiedzi, bo czynników odpowiedzialnych za katalityczną perfekcję enzymów wydaje się być wiele. Rozumiemy, że kluczem do wszystkiego jest właśnie obniżanie energii aktywacji danej reakcji za pomocą tych kilku odpowiednio ulokowanych aminokwasów lub kofaktorów, czyli niewielkich cząsteczek organicznych lub kompleksów metali, które poszerzają spektrum dostępnych chemicznych procesów. Enzymów jest jednak tak wiele  i tak wiele różnych reakcji potrafią przyspieszać, że enzymolodzy mają wiele pracy na kolejne dziesiątki lat badań. W samym ludzkim organizmie ocenia się - na podstawie analizy genomu - że biokatalizatorów może być ponad 2700, katalizujących prawie 900 różnych procesów (Romero et al. 2004). A większość organizmów ziemskich nie została jeszcze scharakteryzowana genetycznie!

Pozostaje pytanie, dlaczego Natura wytworzyła tak skomplikowane cząsteczki, by ostatecznie zbudować coś tak prostego, jak centrum aktywne? Czy enzymy nie mogłyby składać się właściwe tylko z tych kilku kluczowych aminokwasów, które katalizują reakcję? Przecież tak właśnie budujemy nasze katalizatory my, chemicy - i jakoś to działa! Powodów, dla których Natura  wybrała to pozornie bardziej skomplikowane rozwiązanie jest kilka. Po pierwsze, jak już wspomniałem, białka, a w szczególności enzymy, produkują się poniekąd same. Po przetłumaczeniu kodu genetycznego na łańcuch białkowy, sama struktura polimeru białkowego zwija się w docelowy kształt. Ten kształt jest tak zaprojektowany przez ewolucję, aby umieścić katalitycznie aktywne aminokwasy w odpowiedniej, optymalnej pozycji. Co więcej, pozostałe aminokwasy nie tylko stanowią rusztowanie, na którym katalitycznie aktywne aminokwasy są zamocowane, ale również budują kształt centrum aktywnego, które przypomina formę pod odlew rzeźby dla reagujących w reakcji cząsteczek. Innymi słowy cząsteczki reagentów „pasują”, niczym ręka do dobrze dobranej rękawiczki, do centrum aktywnego i każdy fragment cząsteczki chemicznej wchodzi do odpowiedniego „palca” tej rękawiczki. Oczywiście dobre „dopasowanie” reagentu do centrum aktywnego wykracza poza czysto makroskopowe mechaniczne dopasowanie kształtu, chociaż jest to również istotny czynnik (są to tak zwane efekty steryczne). Bardzo ważną rolę pełnią tutaj oddziaływania elektrostatyczne – aminokwasy o naładowanych (dodatnio lub ujemnie) łańcuchach bocznych umieszczone są w takich miejscach, aby korzystnie oddziaływać z przeciwnie naładowanymi grupami substratu lub też umożliwić powstanie stabilizujących kompleks enzymu z substratem wiązań wodorowych.

To właśnie dzięki tym doskonale zaprojektowanym oddziaływaniom centrum aktywnego z substratem enzymy uzyskują niezwykłą przewagę nad naszymi prostymi chemicznymi katalizatorami. Przewagą tą jest selektywność. Rozpoznając kształty i właściwości cząsteczek chemicznych nasza „enzymatyczna rękawica” dba nie tylko o to aby „kciuk” czy „palec wskazujący” cząsteczki trafił w odpowiednie miejsce rękawicy, ale jest też w stanie rozróżnić chemiczną „malutką rączkę dziecka”, od wielkiej „męskiej graby”, czy „kobiecej rączki o długich palcach i wypielęgnowanych paznokciach”. Innymi słowy enzym wybierze z wielu cząsteczek chemicznych pływających w komórkowej cytoplazmie tylko te związki, do których modyfikacji został zaprojektowany. Dzięki tej niezwykłej zdolności w naszych komórkach potrafią biec obok siebie bardzo różne reakcje chemiczne, podczas gdy my, w chemicznej fabryce, musimy każdy z procesów chemicznych prowadzić w osobnym reaktorze, by nasze katalizatory „nie pomyliły się” i modyfikowały tylko jeden wybrany przez nas związek chemiczny.

Selektywność jest  wielką zaletą enzymów i ma bardzo duże znaczenie dla ich zastosowania w przemyśle. Co ciekawe - jest jednocześnie zaletą i wadą biokatalizatorów. Otóż tak długo, jak chcemy odtworzyć w fabryce proces, który występuje w naturze (na przykład chcemy syntetyzować antybiotyk wykorzystując enzymy z grzybów, które naturalnie go wytwarzają), tak długo ta niezwykła selektywność enzymów działa na naszą korzyść. Enzym wytworzy tylko jeden, pożądany przez nas produkt i kompletnie zignoruje zanieczyszczenia. W przemyśle jednak bardzo często chcemy stworzyć cząsteczki, których Natura nie używa albo które zawierają nietypowe atomy. Wtedy ta wysoka specjalizacja biokatalizatorów działa na naszą niekorzyść, bo enzymy są zbyt wysoce wyspecjalizowane, by dobrze przyspieszać przemianę nietypowych cząsteczek. Nietypowe cząsteczki mają bowiem trochę inny chemiczny kształt oraz rozkład ładunków i nie pasują dobrze do centrum aktywnego.  Aby poradzić sobie z tym problemem biotechnolodzy przesiewają wiele enzymów, pochodzących z różnych organizmów, by znaleźć takie, które nie są aż tak bardzo wyspecjalizowane lub posiadają inną, bardziej pasująca do celów danej syntezy, specyficzność substratową. Czasem udaje się znaleźć enzym, którego ewolucja nie doprowadziła jeszcze do skrajnej specjalizacji. Dzięki temu jest on w stanie rozpoznać i związać w centrum aktywnym szerszą gamę związków chemicznych i może służyć naszym celom. Takie poszukiwania przypominają jednak szukanie igły w stogu siana – nigdy nie mamy pewności, że odnajdziemy enzym o pożądanych cechach. Na szczęście dzięki postępom biologii molekularnej nie jesteśmy zdani tylko na łut częścią – i możemy liczyć na pomoc ze strony przyspieszonej ewolucji.
Proces ewolucji polega na stopniowych, losowych zmianach w kodzie genetycznym kodującym sekwencje białek. Enzymy odpowiedzialne za kopiowanie DNA są zazwyczaj bardzo dokładne i bardzo rzadko popełniają błędy. Czasem jednak pojedyncze pomyłki „umkną ich uwadze” i w ten sposób następuje mutacja w DNA. Niekiedy zmiana pojedynczego elementu DNA nie prowadzi do poważnych zmian, czasem zmodyfikowane białko ma własności mniej przydatne niż jego pierwowzór, ale czasem jest ono lepsze. Ponieważ lepsze rozwiązania zwiększają szanse na przeżycie danego organizmu i wydanie na świat potomstwa (a wiec przekazanie nowego typu białka swoim dzieciom) dobre rozwiązania się kumulują a złe eliminują (bo często zmniejszają szansę przeżycia i przekazania gorszego białka potomstwu).

W sztucznie kierowanej ewolucji to my decydujemy, jakie będą warunki „przeżycia” danej losowej mutacji.  Są nim zdolności enzymu do katalizowania wybranej przez nas reakcji chemicznej. Dzięki postępom w dziedzinie biologii molekularnej posiadamy specjalne narzędzia biotechnologiczne umożliwiające częste wprowadzanie losowych jak i celowych zmian w DNA i następnie produkcji białek kodowanych tym DNA w bakteriach. Posiadamy też narzędzia umożliwiające mieszanie się kodu genetycznego pomiędzy podobnymi, homologicznymi genami, w podobny sposób jak w procesie płciowego rozmnażania (Stemmer 1994). Powtarzając ten proces wielokrotnie (niczym kolejne pokolenia w normalnej ewolucji) jesteśmy w stanie przekształcić enzym, który był kiepski, w katalizowaniu nieznanej Naturze reakcji, w super katalizator, który nie tylko przyspieszy reakcję, ale jeszcze zniesie wysokie stężenie rozpuszczalników organicznych, wysoką temperaturę czy jakże odmienne od przytulnego wnętrza komórki warunki panujące w reaktorze chemicznym. Dzięki poszerzającej się wiedzy na temat zależności struktury białek i ich właściwości jesteśmy coraz częściej w stanie przewidywać (za pomocą modelowania komputerowego), jakie modyfikacje należy wprowadzać, by skierować ewolucję w danym kierunku, i jakie rejony białka najlepiej jest poddawać mutacjom. Dlatego nie musimy już poruszać się zupełnie na ślepo, co pozwala optymalizować metodą kierowanej ewolucji mniejsze ilości białek. Co więcej, dzięki technikom inżynierii genetycznej i mikrobiologii jesteśmy w stanie wytwarzać te enzymy w sposób tani i bezpieczny dla środowiska. Wprowadzamy genetyczną instrukcję do pospolitych mikroorganizmów (np. bakterii Escherichii coli czy  drożdży Pichia pastoris), namnażamy je i wydajemy im chemiczny rozkaz nakazujący produkcję pożądanego enzymu. Dzięki takim osiągnięciom genetycznie zmodyfikowane organizmy (czyli GMO) dostarczają nam m.in. tak zwanych rekombinowanych enzymów. Jest to sposób produkcji podpuszczki do produkcji serów (nie musimy więc zabijać jagniąt by ekstrahować enzym z ich żołądków), wytwarzania enzymów rozkładających skrobię do syropu glukozowego (soki słodkie nawet w zimie), czy produkujących lipazy usuwające tłuste plamy z pranej odzieży (tanie proszki zawierające enzymy pozwalają na pranie w niskiej temperaturze, co oszczędza prąd i chroni środowisko). Na marginesie należy wspomnieć, że te same metody inżynierii genetycznej służą do produkcji bardzo cennych leków, takich jak insulina ludzka czy ludzki hormon wzrostu. Leki te również zbudowane są z aminokwasów i wytwarzane są w zmodyfikowanych genetycznie komórkach eukariotycznych (tj. nie bakteryjnych – najczęściej komórkach jajnika chomika chińskiego). Jak więc widać nie należy się ślepo obawiać GMO dla samej zasady – to co modyfikowane genetycznie niejednokrotnie ratuje nasze życie i zdrowie, a przy tym wspiera ochronę środowiska.

Otaczający nas świat zmienia się czasem niepostrzeżenie. Jeszcze 20-30 lat temu enzymy wykorzystywali tylko specjaliści w laboratoriach czy fabrykach farmaceutycznych. Dziś, czasem nieświadomie, wykorzystują je gospodynie domowe (lub samodzielnie robiący pranie mężczyźni) dolewając żelu do prania z formułą enzymatyczną usuwającą plamy z białek, tłuszczu i cukrów. Korzystają z nich piekarze, dodający enzymatycznych polepszaczy, które sprawiają, że chleb jest bardziej sprężysty i aromatyczny, czy kucharze, wykorzystujący enzymatyczne marynaty, by mięso nabrało odpowiedniej miękkości i delikatności. Stosuje się enzymatyczne preparaty proteolityczne, by sklarować piwo produkowane w lokalnym mikro-browarze. No i oczywiście każdy z nas, w każdej sekundzie naszego istnienia, wykorzystuje dziesiątki tysięcy enzymów – po to by po prostu żyć.

Skrócona wersja powyższego felietonu autorstwa prof. Ryszarda Tadeusiewicza została opublikowana w „Dzienniku Polskim” oraz „Gazecie Krakowskiej” 30.6.2023 r.

Wykaz wszystkich publikacji popularnonaukowych prof. Tadeusiewicza wraz z odnośnikami do ich pełnych wersji