Jak zamrozić ścięgno

Zanim tkanki trafią do biorcy zwykle przez jakiś czas są przechowywane w warunkach głębokiego mrożenia (–80℃). Taka krioprezerwacja jest powszechnym sposobem ich przygotowywania do zabiegów allotransplantacji. Niska temperatura sprawia, że ryzyko odrzucenia przeszczepu znacząco maleje, a tkanka może być przechowywana w oczekiwaniu na biorcę przez dłuższy czas. W standardowej procedurze, przed przeszczepieniem, tkanka jest rozmrażana przynajmniej dwukrotnie w celu wykonania niezbędnych badań (np. mikrobiologicznych), a w przypadkach, gdy pochodzi od dawcy wielonarządowego lub gdy niezbędne jest wykonanie dodatkowych badań – nawet wielokrotnie. Nie jest jednak jasne, jaki dokładnie wpływ na właściwości tkanki ma jej wielokrotne mrożenie i rozmrażanie, a tym samym nie istnieją przepisy, które regulowałyby dopuszczalną liczbę cykli mrożenia i rozmrażania (M/R). Dr Martyna Ekiert-Radecka z Wydziału Technologii Kosmicznych zajęła się tym zagadnieniem w trakcie pracy nad doktoratem, który obroniła pięć lat temu. W 2023 roku Narodowe Centrum Nauki przyznało jej grant, który umożliwi jej kontynuowanie badań tego zagadnienia. Projekt „Wieloskalowe badania nad zależną od prędkości odkształcenia odpowiedzią macierzy międzypęczkowej izolowaną od odpowiedzi struktur kolagenowych w ścięgnach na proces wielokrotnego mrożenia” ma na celu zbadanie jak cykle M/R wpływają na poszczególne komponenty ścięgna. W rozmowie z Katarzyną Dziadowicz z Centrum Komunikacji i Marketingu AGH dr Martyna Ekiert-Radecka opowiada nie tylko o planach badawczych, lecz także o rezultatach dotychczasowych badań.

Katarzyna Dziadowicz: Co się dzieje z tkanką w trakcie mrożenia? Jakie właściwości ona traci?

Główną zmianą, jaka zachodzi w tkance podczas mrożenia, jest utrata jej wytrzymałości mechanicznej. Ja w swoich badaniach skupiałam się przede wszystkim na ścięgnie Achillesa – to właśnie ono odgrywa kluczową rolę w pracy naszego stawu skokowego. Każdy z nas codziennie korzysta z tej tkanki, nawet jeśli nie zawsze o tym pamiętamy, kiedy chodzimy, biegamy, wchodzimy po schodach czy uprawiamy sport. Ścięgno Achillesa jest prawdziwym „superbohaterem” wśród tkanek – nieustannie przenosi ogromne obciążenia mechaniczne, dbając o to, byśmy mogli swobodnie się poruszać.

Niestety, wielokrotne mrożenie i rozmrażanie tkanek ścięgnistych, a także sam sposób ich przetwarzania w bankach tkanek – liczba cykli, czas i temperatura przechowywania czy tempo zamrażania i rozmrażania – mogą negatywnie wpływać na właściwości mechaniczne ścięgna. W efekcie takich procesów tkanka może tracić swoją sprężystość, lepkość i zdolność do przenoszenia obciążeń, a to właśnie te cechy są kluczowe dla jej prawidłowego funkcjonowania, zwłaszcza dla potencjalnych biorców takich tkanek.

Czy te parametry się pogarszają już przy pierwszym cyklu mrożenia i rozmrażania?

Według moich badań, nie obserwuje się pogorszenia tych parametrów po pierwszym cyklu mrożenia i rozmrażania, co zbieżne jest z obserwacjami zgłaszanymi przez innych naukowców. Warto jednak zaznaczyć, że badania w mojej pracy doktorskiej i prowadzone w ramach moich projektów naukowych, były realizowane głównie na modelach zwierzęcych. Wynika to z pewnych ograniczeń związanych z prowadzaniem tego typu badań poza uniwersytetem medycznym, gdzie dostęp do ludzkich tkanek jest znacznie łatwiejszy. Chociaż sprawia to, że nie możemy aplikować uzyskanych wyników bezpośrednio na tkanki człowieka, to traktuję te badania jako ważny pierwszy krok, który otwiera drogę do dalszych, już bardziej zaawansowanych analiz na ludzkim materiale.

Więc ile razy możemy mrozić i rozmrażać ścięgno, żeby jego właściwości nie uległy pogorszeniu?

Na podstawie mojej pracy doktorskiej, ustaliłam, że graniczną liczbą cykli mrożenia i rozmrażania są trzy powtórzenia. Po trzecim cyklu obserwowałam już wyraźne pogorszenie sprężystości tkanki, czyli jednej z najważniejszych jej właściwości mechanicznych. Inne parametry, takie jak rozmiar i średnica włókien kolagenowych budujących ścięgno, zaczynają się zmieniać dopiero po około ósmym cyklu. Jeśli więc przyjmiemy za kryterium pierwsze istotne pogorszenie właściwości, to właśnie trzeci cykl mrożenia i rozmrażania jest tym momentem granicznym.

W trakcie trwania obecnego projektu chce Pani badać jaki wpływ ma mrożenie i rozmrażanie na poszczególne komponenty ścięgna. Dlaczego to takie istotne?

To naturalna kolej rzeczy w nauce – każde odkrycie generuje nowe pytania i tak też było w moim przypadku. Po zakończeniu pracy doktorskiej, gdzie określiłam graniczną liczbę cykli mrożenia, zaczęłam się zastanawiać: „Co tak naprawdę dzieje się podczas mrożenia tkanki na poziomie poszczególnych jej komponentów?”. Dotychczas traktowałam bowiem ścięgno jak jednorodny materiał, analizując je przez pryzmat inżynierski mechaniki materiałów. Tymczasem, z biologicznego punktu widzenia, składa się ono z dwóch odrębnych komponentów tzw. faz, czyli z bardziej wytrzymałej, lecz sprężystej fazy włókien kolagenowych oraz lepkiej i uwodnionej macierzy międzywłókienkowej. I to właśnie woda w macierzy wydaje się być kluczowa – podczas mrożenia tworzy kryształy lodu, które mogą inaczej oddziaływać na kolagen niż na otaczającą go „lepką otoczkę”. W moim najnowszym projekcie chcę sprawdzić, czy uszkodzenia tkanki po cyklach M/R dotyczą głównie kolagenu, macierzy, czy obu faz równomiernie. To tak, jakby „rozebrać” ścięgno na części pierwsze i zbadać, która z nich jest bardziej wrażliwa na niskie temperatury. Taka wiedza pomoże w opracowaniu skuteczniejszych metod przechowywania tkanek, dostosowanych do ich specyficznych właściwości lub do potrzeb zgłaszanych przez poszczególnych pacjentów.

Jak prowadzi się takie badania od strony technicznej? Czy to wciąż będą badania na tkankach zwierząt? Skąd pozyskuje się tkanki do badań?

Tak, w obecnym projekcie nadal wykorzystuję tkanki zwierzęce. Na tym etapie badań kluczowe jest dla mnie bowiem ujednolicenie próbek, które będę analizować, dlatego w budżecie projektu uwzględniłam środki na hodowlę zwierząt laboratoryjnych. Dzięki temu mogę kontrolować wiek zwierząt, ich dietę, aktywność fizyczną czy stan zdrowia, co zminimalizuje naturalną bioróżnorodność, która jest nieodłącznym aspektem badań z wykorzystaniem tkanek. W poprzednich projektach współpracowałam z lokalnymi rzeźniami, pozyskując ścięgna zwierząt z hodowli przemysłowych. Choć etycznie uzasadnione, takie podejście wprowadzało zmienne zakłócające – brak pełnych danych o historii zdrowotnej zwierząt czy warunkach ich życia. Teraz, korzystając z kontrolowanych hodowli laboratoryjnych, mogę precyzyjniej analizować wpływ samych cykli mrożenia, bez szumu wynikającego z nieznanych czynników zewnętrznych.

Jeśli chodzi o techniczny aspekt prowadzenia takich badań, obejmuje on pobranie tkanek w sterylnych warunkach, ich dysekcję, a następnie poddanie określonej liczbie cykli mrożenia i rozmrażania lub bezpośrednie testowanie. Wśród serii analiz, które realizuję w nowym projekcie, znajdują się m.in.: testy mechaniczne na maszynie wytrzymałościowej, obrazowanie mikroskopowe, analiza immunohistochemiczna oraz badania z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego. Każdy etap wymaga ścisłej standaryzacji – zarówno w zakresie przechowywania próbek w określonych temperaturach, jak i stosowanych protokołów badawczych dla każdej z metod. Liczba analizowanych próbek jest również duża. To żmudna praca, ale niezbędna, aby uzyskane wyniki były wiarygodne i powtarzalne.